Príchod technológie krykonzervácie spolu s metódami umelej inseminácie priniesli revolúciu v chove hovädzieho dobytka po celom svete vďaka zlepšeniu efektivity chovu, zvýšeniu fertilizačného potenciálu plemenných býkov a možnosti využitia ich kvalitného genetického materiálu s cieľom väčšieho počtu kráv.
Kryobiológia patrí medzi multidisciplinárne vedy zaoberajúce sa štúdiom fyzikálnych a biologických procesov prebiehajúcich v bunkách a tkanivách pri nízkych tzv. kryogénnych teplotách (Benson a kol., 2012). Vôbec prvé pokusy spojené s kryoprezerváciou ejakulátu cicavcov sa datujú do roku 1784, keď taliansky vedec Lazzaro Spallanzani použil v snehu chladený ejakulát psa a úspešne inseminoval sučku, ktorej sa narodili tri šteňatá. Neskôr v roku 1899, ruský biológ Ilja Ivanovič Ivanov vyvinul praktické metódy a protokoly umelej inseminácie hospodárskych zvierat. Avšak azda za najväčší míľnik v oblasti kryouchovávania spermií sa považuje rok 1940, keď Phillips a Lardy využili vaječný žĺtok ako kryoprotektívne aditívum na ochranu spermií počas kryokonzervácie. O pár rokov neskôr v roku 1949, Polge a kol. potvrdili kryoprotektívne účinky glycerolu (Ombelet a Van Robays, 2015). V porovnaní s ostatnými druhmi hospodárskych zvierat je v súčasnosti kryokonzervácia spermií býkov zvládnutá metodicky najlepšie. Aj napriek tomu životaschopnosť spermií po rozmrazení klesá a medzi rôznymi plemenníkmi sa líši. Odstránenie týchto nedostatkov by znamenalo pokrok v oblasti krykonzervácie pre účely reprodukčných biotechnológií a zlepšenie kvality rozmrazených vzoriek pre účely umelej inseminácie (Ugur a kol., 2019). Procesy, ktoré sú zodpovedné za letálne alebo subletálne poškodenie spermií počas kryokonzervácie nie sú doposiaľ dostatočne vedecky podložené. Nízke tzv. kryogénne teploty počas procesu mrazenia majú negatívny vplyv na kvalitatívne a kvantitatívne parametre spermií býkov. V konečnom dôsledku tieto zmeny vedú k poklesu pohyblivosti (motility), životaschopnosti, membránovej integrity, poškodeniu DNA až bunkovej smrti (apoptóze). Počas kryokonzervácie sú spermie vystavené rôznym fyziologickým a štrukturálnym zmenám. Medzi najčastejšie kontraidikácie spojené s kryouchovávaním bovinných spermií (obr.1) zaraďujeme tvorbu ľadových kryštálikov, oxidatívny stres, bakteriálnu kontamináciu, predčasnú kapacitáciu tzv. kryokapacitáciu a prípadné cytotoxické účinky kryoprotektantov (Singh a kol., 2014). Kryobiológia v súčasnosti zastáva dôležité miesto v reprodukcii hospodársky významných zvierat, a preto je nutné neustále zlepšovať a vyvíjať nové protokoly a technológie, ktoré by zvýšili kvalitu kryokonzervovaných vzoriek po ich rozmrazení, čím by sa zvýšila úspešnosť umelej inseminácie.
Problémy súvisiace s kryokonzerváciou
Tvorba ľadových kryštálikov
Kryokonzervácia umožňuje dlhodobé uchovávanie živých buniek a tkanív. Pozastavenie metabolizmu a fyziologických aktivít buniek je spôsobené vplyvom nízkych teplôt počas mrazenia. Tento proces však môže spôsobiť nezvratné poškodenie buniek vedúce buď k nekróze alebo bunkovej smrti (Gao a Critser, 2000; Ozaydin a Celik, 2012). Hlavným problémom nie je schopnosť buniek znášať skladovanie pri kryogénnych teplotách (pod -190 °C), väčšina komplikácií nastáva práve v rozmedzí teplôt od -130 po -15°C. Tento prechod medzi teplotami musia spermie zvládnuť 2-krát, raz počas zmrazovania a neskôr počas ich rozmrazovania (Ӧztürk a kol., 2019). Regulácia vody do alebo von z bunky počas mrazenia a rozmrazovania je riadená špeciálnymi proteínovými kanálikmi tzv. akvaporínmi (AQP). Mnohé z nich ako napr. AQP7, AQP8 a AQP11 boli identifikované aj na membráne spermií býkov. AQP7 zodpovedá za metabolizmus glycerolu, zatiaľ čo AQP8 je zodpovedný za výmenu vody v bunke (Yueng, 2010). Počas kryokonzervácie dochádza najskôr k tvorbe ľadových kryštálov vnútri bunky, čím sa zvyšuje množstvo extracelulárnej tekutiny mimo buniek. Pri rýchlom mrazení nastáva osmotická nerovnováha v dôsledku difúznej kryštalizácie ľadu v extracelulárnej tekutine. Tento jav má za následok zvýšenie tlaku, ktorý je tvorený ľadovými kryštálmi, pričom rozširuje subakrozomálnu oblasť spermie a poškodzuje lipidovú štruktúru membrán spermií, čo vedie k ich poškodeniu. Zmeny osmolarity a prítomnosť intracelulárnych ľadových kryštálov vedú k zmenám v konsolidačnej architektúre proteínov a sacharidov, ktoré spôsobujú defekty membránových štruktúr a znižujú tak životaschopnosť spermií (Morris a kol., 2011; Hezavehei a kol., 2018)...
Celý text nájdete v októbrovom vydaní Slovenského CHOVu na s.16-17
Časopis Slovenský CHOV si môžete predplatiť tu.
Literatúra je k dispozícii u autorov
Ing. Filip Benko, PhD.1*, Ing. Eva Tvrdá, PhD.1, prof. Ing. Norbert Lukáč, PhD.2
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
